HR Excellence in Science

Dostupné zobrazovací techniky

 

Příprava biologických vzorků a jejich zobrazení v TEM

Standardní metody přípravy vzorků pro TEM

Vzorky připravujeme metodou HPF/FS (tj. mražení za vysokého tlaku, mrazová substituce ledu; metodika: s41598-020-74033-9 ) nebo chemickou cestou (fixace roztokem glutaraldehydu, post-fixace OsO4, odvodnění). Vzorky jsou poté zality do epoxidové pryskyřice. Před prohlížením v TEM, jsou ze vzorků pomocí ultramikrotomu nakrájeny ultratenké řezy, které jsou kontrastovány.

Replikace TBEV v endoplazmatickém retikulu

 

 

Metody přípravy vzorků pro imunolokalizace

Imunolokalizace proteinů pomocí protilátek konjugovaných se zlatými nanočásticemi  provádíme na ultratenkých řezech - metoda Tokuyasu (DOI: 10.1016/j.cub.2018.09.008; nebo DOI: 10.1038/s41598-019-43284-6) nebo řezech pryskyřic LR White a Lowicryl K4M po UV polymerizaci při nízkých teplotách v AFS jednotce.  Imunolokalizaci struktur provádíme i po adherenci vzorků na povrch síťky (metoda negativního kontrastu). Příklady vícečetné lokalizace: (DOI: 10.1073/pnas.1909755117 a DOI: 10.1016/j.nano.2015.09.008).

 

 

Imunolokalizaze ATPáz v mitochondriích trypanozom

 

Elektronová tomografie (ET)

Metoda 3D rekonstrukce prováděná na kontrastovaných řezech s maximální tloušťkou 200 nm, která dosahuje rozlišení ~ 1 nm.  Rekonstruovaná plocha je úměrná zvětšení TEM a pohybuje se od 10×10 µm @ px=2,8 nm, do 0,5×0,5 µm @ px=0,14 nm (DOI:10.1038/srep10745, DOI:10.1007/s00436-018-6001-9)  Rekonstruovaný objem lze rozšířit spojováním tomogramů ve všech osách (DOI:10.1016/j.cub.2018.09.008)

 

Vlevo:Replikace TBEV v endoplazmatickém retikulu, vpravo: IRIDOVIRUS

 

SPA - single particle analysis

Tato metoda zpracovává velké množství různě orientovaných částic studované makromolekuly zobrazených pomocí TEM. Z těchto dat je poté rekonstruována struktura dané makromolekuly ve 2D (RT-EM, negativní barvení) a ve 3D (kryo-EM, plunge freezing). Kryo-EM v kombinaci s přímým detektorem elektronů může dosáhnout v rekonstrukcích až téměř atomárního rozlišení.

 

 

P4   

  

Kryo-ET

Kryo-ET je metoda, která umožňuje 3D rekonstrukci nativního vzorku imobilizovaného v amorfním ledu s rozlišením ~ 4 nm (závisí na radiační citlivosti vzorku). Nejjednodušší příprava vzorku je rychlým zamražením - ponořením tenké vrstvy suspenze do kapalného etanu (plunge freezing); další možností je příprava kryořezů z nativního vzorku při teplotě nižší než -140°C (DOI:10.1016/j.ijpara.2020.09.010)

 

Extracelulární váček vyloučený modelovou tasemnicí Hymenolepis diminuta

 

 

Průměrování částí tomogramů (STA)

STA je výpočetní metoda, která umožňuje zvýšit rozlišení ET a Kryo-ET až na desetiny nm. Aplikuje se na tvarově stejné objekty - např. ribozomy, jaderné póry, viry.

 

 

 

STA analýza lamel chlorozomu tvořených fotosyntetickými pigmenty

 

 

 

Příprava biologických vzorků a jejich zobrazení v SEM

Standardní metody přípravy vzorků pro SEM

Standardní metoda přípravy zahrnuje kroky: fixace roztokem glutaraldehydu, postfixace OsO4, odvodnění, sušení metodou CPD a pokovení (DOI:10.1016/j.protis.2010.02.004)

 

 

Hnida přichycená na vlasu

 

Kryo-SEM

Možnost pozorování povrchů nebo lomů vzorků zamražených pomocí HPF nebo ponořených do tekutého etanu či dusíkové tříště. Mrazové lámání, mrazová sublimace a pokovení zlatem je prováděno v komoře CryoALTO 2500 (DOI: 10.1007/s10493-019-00442-9).

 

Trichoma na listu

 

                        

SBF-SEM - Serial Block Face-Scanning Electron Microscopy je metoda objemové skenovací elektronové mikroskopie. V komoře SEM je umístěn ultramikrotom, pomocí kterého je z povrchu vzorku (tj. bločku o velikosti cca 200umx200um) odkrojen ultratenký řez. Povrch vzorku je nasnímán pomocí detektoru zpětně odražených elektronů. Rozlišení při optimálních parametrech dosahuje 6-15 nm v rovině XY, 40-100 nm v ose Z. Výsledkem je série obrázků, která je následně upravena pomocí různých softwarů (MAPS, Amira, ImageJ, MIB...). Tento dataset je dále možné segmentovat (Amira, MIB) pro přesná měření v řádu nm/nm3 a případně vytvořit 3D model pozorovaných struktur.

Trypanosoma brucei, 3D model zahrnující různé části buňky

 

Array tomography

Metoda objemové skenovací elektronové mikroskopie založená na snímání sériových řezů vzorků umístěných na sklíčku nebo waferu pomocí SEM, úprava nasnímaných obrázků softwarem Amira s možností tvorky 3D modelu. (DOI:10.1038/s41598-019-56811-2

Odkaz na video Array tomography.

 

Zpracování dat

Naše laboratoř nabízí také možnost zpracování/ pomoc při zpracovávání zde naměřených dat: pre-processing, alignment tomogramů, průměrování dílčích tomogramů, segmentaci + 3D vizualizaci v progamech AMIRA, MIB, IMOD a ImageJ, k dispozici jsou 2 pracovní stanice, uvedené v sekci mikroskopy a počítače.

 

KONTAKT

Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Branišovská 1160/31
370 05 České Budějovice
Datová schránka: r84nds8

 

+420 387 775 111 (ústředna)
+420 387 775 051 (sekretariát)
+420 778 468 552 (pro média)

NAJÍT PRACOVNÍKA

Biologické centrum Google mapa

Přihlášení do intranetu

Pro přihlášení do intranetu zadejte Vaše přihlašovací údaje

×