Dostupné zobrazovací techniky
Příprava biologických vzorků a jejich zobrazení v TEM
Standardní metody přípravy vzorků pro TEM
Vzorky připravujeme metodou HPF/FS (tj. mražení za vysokého tlaku, mrazová substituce ledu; metodika: s41598-020-74033-9 ) nebo chemickou cestou (fixace roztokem glutaraldehydu, post-fixace OsO4, odvodnění). Vzorky jsou poté zality do epoxidové pryskyřice. Před prohlížením v TEM, jsou ze vzorků pomocí ultramikrotomu nakrájeny ultratenké řezy, které jsou kontrastovány.
Replikace TBEV v endoplazmatickém retikulu
Metody přípravy vzorků pro imunolokalizace
Imunolokalizace proteinů pomocí protilátek konjugovaných se zlatými nanočásticemi provádíme na ultratenkých řezech - metoda Tokuyasu (DOI: 10.1016/j.cub.2018.09.008; nebo DOI: 10.1038/s41598-019-43284-6) nebo řezech pryskyřic LR White a Lowicryl K4M po UV polymerizaci při nízkých teplotách v AFS jednotce. Imunolokalizaci struktur provádíme i po adherenci vzorků na povrch síťky (metoda negativního kontrastu). Příklady vícečetné lokalizace: (DOI: 10.1073/pnas.1909755117 a DOI: 10.1016/j.nano.2015.09.008).
Imunolokalizaze ATPáz v mitochondriích trypanozom
Elektronová tomografie (ET)
Metoda 3D rekonstrukce prováděná na kontrastovaných řezech s maximální tloušťkou 200 nm, která dosahuje rozlišení ~ 1 nm. Rekonstruovaná plocha je úměrná zvětšení TEM a pohybuje se od 10×10 µm @ px=2,8 nm, do 0,5×0,5 µm @ px=0,14 nm (DOI:10.1038/srep10745, DOI:10.1007/s00436-018-6001-9) Rekonstruovaný objem lze rozšířit spojováním tomogramů ve všech osách (DOI:10.1016/j.cub.2018.09.008)
Vlevo:Replikace TBEV v endoplazmatickém retikulu, vpravo: IRIDOVIRUS
SPA - single particle analysis
Tato metoda zpracovává velké množství různě orientovaných částic studované makromolekuly zobrazených pomocí TEM. Z těchto dat je poté rekonstruována struktura dané makromolekuly ve 2D (RT-EM, negativní barvení) a ve 3D (kryo-EM, plunge freezing). Kryo-EM v kombinaci s přímým detektorem elektronů může dosáhnout v rekonstrukcích až téměř atomárního rozlišení.
P4
Kryo-ET
Kryo-ET je metoda, která umožňuje 3D rekonstrukci nativního vzorku imobilizovaného v amorfním ledu s rozlišením ~ 4 nm (závisí na radiační citlivosti vzorku). Nejjednodušší příprava vzorku je rychlým zamražením - ponořením tenké vrstvy suspenze do kapalného etanu (plunge freezing); další možností je příprava kryořezů z nativního vzorku při teplotě nižší než -140°C (DOI:10.1016/j.ijpara.2020.09.010)
Extracelulární váček vyloučený modelovou tasemnicí Hymenolepis diminuta
Průměrování částí tomogramů (STA)
STA je výpočetní metoda, která umožňuje zvýšit rozlišení ET a Kryo-ET až na desetiny nm. Aplikuje se na tvarově stejné objekty - např. ribozomy, jaderné póry, viry.
STA analýza lamel chlorozomu tvořených fotosyntetickými pigmenty
Příprava biologických vzorků a jejich zobrazení v SEM
Standardní metody přípravy vzorků pro SEM
Standardní metoda přípravy zahrnuje kroky: fixace roztokem glutaraldehydu, postfixace OsO4, odvodnění, sušení metodou CPD a pokovení (DOI:10.1016/j.protis.2010.02.004)
Hnida přichycená na vlasu
Kryo-SEM
Možnost pozorování povrchů nebo lomů vzorků zamražených pomocí HPF nebo ponořených do tekutého etanu či dusíkové tříště. Mrazové lámání, mrazová sublimace a pokovení zlatem je prováděno v komoře CryoALTO 2500 (DOI: 10.1007/s10493-019-00442-9).
Trichoma na listu
SBF-SEM - Serial Block Face-Scanning Electron Microscopy je metoda objemové skenovací elektronové mikroskopie. V komoře SEM je umístěn ultramikrotom, pomocí kterého je z povrchu vzorku (tj. bločku o velikosti cca 200umx200um) odkrojen ultratenký řez. Povrch vzorku je nasnímán pomocí detektoru zpětně odražených elektronů. Rozlišení při optimálních parametrech dosahuje 6-15 nm v rovině XY, 40-100 nm v ose Z. Výsledkem je série obrázků, která je následně upravena pomocí různých softwarů (MAPS, Amira, ImageJ, MIB...). Tento dataset je dále možné segmentovat (Amira, MIB) pro přesná měření v řádu nm/nm3 a případně vytvořit 3D model pozorovaných struktur.
Trypanosoma brucei, 3D model zahrnující různé části buňky
Array tomography
Metoda objemové skenovací elektronové mikroskopie založená na snímání sériových řezů vzorků umístěných na sklíčku nebo waferu pomocí SEM, úprava nasnímaných obrázků softwarem Amira s možností tvorky 3D modelu. (DOI:10.1038/s41598-019-56811-2)
Odkaz na video Array tomography.
Zpracování dat
Naše laboratoř nabízí také možnost zpracování/ pomoc při zpracovávání zde naměřených dat: pre-processing, alignment tomogramů, průměrování dílčích tomogramů, segmentaci + 3D vizualizaci v progamech AMIRA, MIB, IMOD a ImageJ, k dispozici jsou 2 pracovní stanice, uvedené v sekci Pracovní stanice pro zpracování dat.